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《重慶醫科大學》 2019年
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細粒棘球縧蟲AQP-9多肽抗體的制備及免疫定位

李锴  
【摘要】:目的:建立经济、高效的非疫区实验室细粒棘球蚴生发细胞的原代培养方法。制备细粒棘球绦虫水通道蛋白9的多克隆抗体,确定其在细粒棘球蚴生发细胞内的细胞定位及在原头蚴、棘球蚴囊壁中的组织分布。为进一步研究细粒棘球蚴水通道蛋白与囊液形成之间的关系奠定基础。方法:1.0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液对鼠源次生细粒棘球蚴囊壁消化10~30 min后进行贴壁,探究最佳消化时间。2.倒置显微镜下观察以最佳消化时间消化后的细粒棘球蚴囊壁残片贴壁培养法和单纯组织贴壁培养法行生发细胞培养的细胞形态改变并对比生长曲线。3.免疫荧光鉴定经残片培养法获得的细粒棘球蚴生发细胞。4.行经残片培养法获得的细粒棘球蚴生发细胞的小鼠腹腔返种试验并取病变组织行HE染色后观察。5.利用生物信息学的方法预测Eg AQP 9的亚细胞定位。6.利用生物信息学的方法分析并设计EgAQP 9序列免疫多肽并免疫新西兰兔。7.SDS-PAGE检测制备的Eg AQP 9多肽抗体的纯化效果,酶联免疫吸附试验测定该多抗滴度。8.免疫印迹法鉴定EgAQP 9蛋白。免疫荧光检测EgAQP 9在细粒棘球蚴生发细胞内的细胞定位,免疫组化检测EgAQP 9在原头蚴、棘球蚴囊壁中的组织分布。结果:1.10 min为胰蛋白酶溶液的最佳消化时长,消化后培养第2~4天后棘球蚴囊壁残片边缘游出的生发细胞具备较好的完整性。2.最佳消化时间条件下的残片培养法和单纯组织贴壁法的生长曲线均似“S”形,两种培养方法的生发曲线的对数生恒久间隔相近,然而残片培养法细胞的增殖水平显著高于单纯囊壁组织贴壁培养法。3.免疫荧光试验证实残片培养法得到的细胞含有细粒棘球蚴抗原身分。4.残片培养法培养的细胞返种试验可观察到小鼠腹腔有新生细粒棘球蚴囊泡结构,而且HE染色后于光学显微镜下能发现发育中的细粒棘球蚴囊泡的囊壁生发层与角皮层。5.利用生物信息学的方法预测EgAQP 9的亚细胞定位显示该蛋白主要分布于细胞膜、线粒体和内质网。6.利用生物信息学的方法分析、设计EgAQP 9多肽的氨基酸序列:ASEEHSTDEDEDTEA,利用合成的多肽免疫新西兰兔制备多肽抗体。7.SDS-PAGE显示研制的EgAQP 9多肽抗体的纯度较好。ELISA测定该多抗滴度效价达1:256 000。8.免疫印迹显示条带所在位置与EgAQP 9分子量大小基本吻合。免疫荧光显示天然的EgAQP 9主要分布于细粒棘球蚴生发细胞的胞质、胞膜中,与生信预测结果基本吻合。免疫组化检测EgAQP 9主要分布于原头蚴虫体外貌,细粒棘球蚴鼠囊泡及感染细粒棘球蚴羊囊泡的生发层。结论:1.0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化鼠源次生棘球蚴囊壁10 min,其残片贴壁培养可乐成培养出活性正常的生发细胞。该方法充实利用保种小鼠体内的次生棘球蚴组织,可为细粒棘球蚴生发细胞的相关研究奠定基础。2.生物信息学软件分析EgAQP 9的氨基酸序列、设计并合成EgAQP 9序列免疫多肽,免疫新西兰兔制备EgAQP 9多肽抗体。实验确定EgAQP 9蛋白在细粒棘球蚴生发细胞内、原头蚴和鼠源次生细粒棘球蚴囊壁、羊源棘球蚴囊壁中的分布,可为进一步研究EgAQP 9可能在囊化过程中的囊液生成过程中发挥的作用及细粒棘球绦虫水通道蛋白的功能代谢特点做铺垫。
【學位授予單位】:重慶醫科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2019
【分類號】:R392

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