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《重慶醫科大學》 2019年
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肌動蛋白解聚對巨噬細胞TLRs的表達及細胞凋亡的影響

賀靜榮  
【摘要】:配景:巨噬细胞作为机体固有免疫的“哨兵”,可通过位于细胞外貌的各类模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRS)识别病原相关模式分子(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为关键的PRRs,接受炎症刺激后可通过核转录因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信号通路产生促炎因子,到场炎症反应。在由脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等促炎因子介导的炎症反应中,TLRs/纤维肌动蛋白(Fibrous actin,F-actin)通路广泛存在于巨噬细胞及肺癌等肿瘤细胞内,但是巨噬细胞、TLRs、F-actin及肿瘤细胞之间可能存在的相关性尚未完全分析。TLRs/F-actin通路相关的顺向模式的研究已有报道,但关于通过干预F-actin聚合以反馈调节巨噬细胞TLRs的表达及其对细胞凋亡的影响的研究,尚未见报道。目的:本研究的目的是探讨肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs表达、细胞凋亡的影响。用差异浓度松胞菌素D(cytochalasin D,cytD)处置小鼠巨噬细胞RAW264.7,分析巨噬细胞TLRs表达水平的变化。构建pEGFPN1-Cofilin-1(缩写为pEGFP-N1-CFL1)质粒并转染巨噬细胞,研究巨噬细胞内源性过表达的丝切蛋白1(Cofilin-1)对RAW264.7细胞的骨架、TLRs表达及细胞凋亡等方面的影响。方法:1.构建pEGFP-N1-CFL1重组质粒。将RAW264.7细胞分为转染pEGFP-N1空质粒的空质粒对比组、转染pEGFP-N1-CFL1重组质粒的重组质粒转染组以及不做处置的空细胞组,荧光显微镜检测细胞的荧光蛋白表达情况。2.重组质粒pEGFP-N1-CFL1转染RAW264.7细胞后,Real-Time PCR和Western blot分别检测转染前后Cofilin-1 mRNA及Cofilin-1蛋白表达水平,荧光显微镜检查细胞骨架重排情况,计算细胞骨架重排率。3.分别用0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM的cytD处置RAW264.7细胞48h,观察细胞的状态。Western blot法检测6组cytD处置组细胞、RAW264.7细胞转染pEGFP-N1-CFL1重组质粒前后的TLR2、TLR4、TLR9的表达水平。流式细胞仪检测pEGFP-N1-CFL1重组质粒转染组细胞的凋亡情况。结果:1.酶切验证及基因测序证明重组质粒pEGFP-N1-CFL1构建乐成,质粒转染RAW264.7巨噬细胞后可观察到较强的荧光。2.pEGFP-N1-CFL1质粒转染RAW264.7细胞后,转染细胞的Cofilin-1 mRNA的转录水平以及Cofilin-1蛋白的表达水平显著增多(P0.05)。细胞骨架重排率从高至低依次为空质粒对比组、空细胞组、重组质粒转染组。重组质粒转染组RAW264.7细胞骨架重排率显著低于其余两组(P0.05)。3.Western blot结果表明,终浓度≥1.5μM的cytD处置细胞时,TLR2显著下降(P0.05);终浓度≥1.0μM cytD处置细胞时,细胞表达的TLR4、TLR9显著下降(P0.05);pEGFP-N1-CFL1重组质粒转染组巨噬细胞的TLRs(TLR2、TLR4、TLR9)的表达水平均显著低于对比组(P0.05)。流式细胞术结果表明,pEGFP-N1-CFL1重组质粒转染组细胞的凋亡水平显著低于对比组(P0.05)。结论:1.外源性解聚因子cytD和内源性过表达的Cofilin-1均可引起巨噬细胞内F-actin的解聚。2.差异浓度的cytD可选择性下调巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达。3.Cofilin-1的过表达可显著下调巨噬细胞TLRs的表达,并降低细胞的凋亡率。
【學位授予單位】:重慶醫科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2019
【分類號】:R392

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